LifeGene Molecular LabService – Microbiologia e Virologia Molecolare

 

Cod. CHLT: Ricerca molecolare di Chlamydia trachomatis

La Chlamydia Trachomatis é il principale agente eziologico di patologie a prevalente trasmissione sessuale quali: uretrite non gonococcica (NGU) e post-gonococcica (blenorragia da inclusioni), epididimite, vaginite, sindrome uretrale acuta e, nella donna, malattia pelvica infiammatoria che spesso sfocia nella sterilità di coppia. Altre patologie correlate all’infezione da Chlamydia Tr. sono rappresentate essenzialmente dal linfogranuloma venereo, tracoma, che porta spesso a cecità, dalla congiuntivite da “corpi inclusi” e polmoniti, frequenti nei neonati, contagiati nell’attraversamento del canale cervicale, durante il parto. La Diagnostica Convenzionale La diagnosi di laboratorio di infezione in atto si basa essenzialmente sulla dimostrazione della Chlamydia Tr. nel materiale patologico. Utile a tale scopo é l’isolamento in colture cellulari e la ricerca microscopica di “corpi elementari” con tecniche di immunofluorescenza o mediante metodi indiretti immunoenzimatici (ELISA). Queste metodiche sono spesso inficiate dalla incostante presenza nel materiale patologico di quantità di microrganismo adeguate alla rilevazione. La diagnosi sierologica, volta alla dimostrazione della presenza di anticorpi nel siero del paziente, non sempre fornisce risultati attendibili al di fuori dei rari casi in cui sia possibile osservare una evidente sieroconversione. La Diagnostica Molecolare: Un netto incremento della specificità e soprattutto della sensibilità nella diagnosi di patologie Chamydia-correlate é reso possibile dalla determinazione diretta del DNA di tale patogeno, mediante la tecnica di PCR. Per mezzo di tale metodica, infatti, é possibile individuare una specifica regione del genoma di Chlamydia Tr. permettendo una diagnosi precisa anche in quei campioni (urina, sangue) in cui il parassita può avere scarsa o nulla vitalità oppure carica microbica molto bassa (secreti congiuntivali, liquidi seminali e sinoviali). Infatti, é proprio in questi casi che si determinano le condizioni cliniche sfavorevoli (latenza, asintomaticità e cronicizzazione), che sono alla base dell’ elevata incidenza del contagio. 

Cod. NG: Ricerca molecolare di Neisseriae gnorrhoeae

La Gonorrea è un’infezione dovuta ad un batterio Gram-negativo, la Neisseria Gonorrhoeae . Si tratta di una delle più comuni infezioni batteriche a trasmissione sessuale e perciò il suo controllo è una priorità per la sanità pubblica: è obbligatoria la sua denuncia. I sintomi si manifestano dopo 2-7 giorni dal contagio. Sono molto più evidenti nei maschi, che presentano un’emissione mucopurulenta a livello dell’uretra (il dotto che porta l’urina dalla vescica all’esterno del corpo) con bruciore e frequente stimolo alla minzione. Può portare a epididimiti, ovvero l’infiammazioni dell’epididimo. Le infiammazioni pelviche si possono diffondere dal tratto genitale inferiore coinvolgendo prima le tube di Fallopio e poi le ovaie. La conseguenza dell’infiammazione è spesso la sterilità . I sintomi hanno inizio con dolore addominale, accompagnato da stanchezza, brividi e febbre bassa. In seguito compare un dolore localizzato. In caso di rapporti anali può causare proctiti , infiammazioni della regione ano-rettale, mentre con rapporti orali può causare faringiti. Neisseria Gonorrhoeae E’ un cocco Gram-negativo, asporigeno, aerobio obbligato, ossidasi positivo, immobile, che si presenta all’esame microscopico con l’aspetto caratteristico di “chicco di caffè”. E’ molto sensibile agli agenti chimico-fisici, per cui il suo habitat naturale è ristretto alle mucose dell’uomo che è anche l’unico serbatoio di questo patogeno.

Cod. MYH: Ricerca molecolare di Mycoplasma hominis

Mycoplasma hominis è un microrganismo che popola il tratto genitourinario di alcuni uomini e donne, specie di quelli sessualmente attivi. La sua presenza in queste sedi può avere sia significato commensale (non crea alcuna sofferenza o disturbo) che patologico. In quest’ultimo caso, il Mycoplasma hominis è comunemente implicato nella genesi della vaginosi batterica e della malattia infiammatoria pelvica, insieme a Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae. Come tale, il Mycoplasma hominis può causare infertilità, aborto spontaneo, endometriti, salpingiti, rottura precoce delle membrane, infezioni corion-amniotiche e scarso sviluppo del neonato. Nel maschio può invece determinare infertilità, uretriti, prostatiti e pielonefriti. Dal momento che questo microrganismo viene spesso isolato insieme ad alti agenti infettivi, il suo grado di patogenicità è comunque incerto. Favorito dalle scarse difese immunitarie, il Mycoplasma hominis può anche essere causa di svariate forme morbose in sede extragenitale. Le percentuali di colonizzazione, sia nel sesso maschile che in quello femminile, sono correlate all’attività sessuale (partners diversi), ma la trasmissione dell’infezione può avvenire anche in modo verticale dalla madre al figlio. I dati presenti in letteratura sono discordanti; mediamente il Mycoplasma hominis si riscontra in circa il 20 – 50% delle donne sessualmente attive ed in percentuali un po’ inferiori nei maschi. Il trattamento utilizzato per debellare l’infezione da Mycoplasma hominis si avvale di antibiotici che interferiscono con la sintesi proteica, come l’azitromicina e la doxiciclina.I micoplasmi sono le più piccole cellule capaci di vita autonoma, con distribuzione cosmopolita. Immobili, privi di parete cellulare rigida e come tali di morfologia estremamente variabile (sferica, filamentosa), i micoplasmi umani comprendono i generi  Mycoplasma ed Ureaplasma (micoplasmi in grado di idrolizzare l’urea). Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum sono le specie patogene più frequentemente isolate dall’apparato genitourinario.

Cod. UU: Ricerca molecolare di Ureplasma urealyticum

L’Ureaplasma urealyticum è un mycoplasma del genere Ureaplasma. In tutti i mammiferi i mycoplasmi colonizzano più comunemente le vie respiratorie e le vie genitali. La colonizzazione vaginale in gravidanza da parte dell’U. urealyticum varia dal 40 all’80% in funzione di vari fattori. Sembrerebbe al momento attuale che la colonizzazione delle alte vie genitali femminili con l’U. urealyticum ed ancor più lo sviluppo di una malattia infettiva legata alla sua presenza si associno a numerose complicanze della gravidanza e del periodo perinatale come aborto ricorrente, crioamnionite, parto pretermine, nascita di neonato di basso peso o di nato morto, malattia febbrile nel postpartum, mentre questo non avverrebbe in caso di semplice colonizzazione delle basse vie genitali. La trasmissione verticale dell’U.urealyticum varia dal 18 al 55%; il tipo di parto non sembra avere influenza sulla trasmissione, mentre importante sarebbe la presenza di corioamniosite. La colonizzazione del neonato comunque raramente comporta una malattia infettiva nel neonato a termine, mentre può determinare malattia anche grave in neonati pretermine in particolare con peso <1500 g. La colonizzazione delle vie respiratorie in neonati pretermine con malattia delle membrane ialine o con malattia polmonare cronica (CLD) sembra aggravarne il decorso clinico. La diagnosi di infezione da U. urelayticum è difficile per le caratteristiche biologiche dell’organismo. I materiali su cui effettuare indagini colturali sono rappresentati da tessuto placentare e, nel neonato, da aspirato tracheale, sangue, liquor, urine, aspirato gastrico e qualsiasi liquido biologico si sospetti contaminato Sono necessari appositi terreni di coltura e quando non è possibile esaminare immediatamente il campione sono necessari particolari terreni di trasporto; inoltre la crescita può richiedere più giorni. L’impiego della tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR) elimina tutti i problemi degli esami colturali ed ha mostrato maggiore sensibilità; tale tecnica tuttavia nella diagnosi di infezione da U. urealyticum è per il momento limitata quasi esclusivamente al campo sperimentale.

Cod. HPV: Ricerca e tipizzazione HPV (Papilloma Virus Umano)

Il cancro della cervice è, come diffusione, la seconda forma di neoplasia nella donna. Molti studi epidemiologici hanno messo ormai in evidenza come l’ infezione da HPV sia il più importante fattore etiologico nello sviluppo di questo carcinoma . In particolare tre tipi di Papillomavirus, HPV 16, 18 e 31, sembrano essere correlati con lo sviluppo del carcinoma della cervice.  L’amplificazione diretta da campione mediante gli strumenti di biologia molecolare è ancora una volta il metodo più veloce ed efficace per una diagnosi corretta che consenta di eseguire poi i necessari e periodici accertamenti diagnostici sui soggetti a rischio. E’ oggi infatti possibile identificare in tempi brevi da un campione che può essere sia una biopsia che un semplice pap-test, non solo la presenza del virus ma la sua appartenenza ai vari tipi (es. Papilloma 6 , 11 , 16 , 18 , 31 , 33 , 34 , 35 , 39 , 40 , 42 , 43 , 44 , 45 , 51 , 52 , 54 , 56 , 58, o altri tipi meno frequenti). L’attribuzione del tipo virale viene condotta mediante ibridazione inversa con sonde oligonucleotiche marcate specifiche per l’identificazione di 33 ceppi di Papilloma Virus Umano.

Cod. CMVI: CMV-DNA (Cytomegalovirus) Qualitativo

l Citomegalovirus, il più grande virus della famiglia degli herpesvirus, è ubiquitario, altamente specie-specifico e riconosce l’uomo come unico ospite. Il suo ciclo replicativo è diviso in tre fasi: molto precoce, precoce e tardiva. L’infezione da CMV è endemica in tutto il mondo. La prevalenza degli anticorpi aumenta con l’età con differenze legate in massima parte alle condizioni socioeconomiche, all’area geografica ed alla razza; in genere la prevalenza di sieropositività (cioè la presenza di anticorpi specifici) è maggiore nei paesi in via di sviluppo e nei ceti a più basso livello socioeconomico. In considerazione di questi fattori la percentuale di sieropositività tra le donne in età fertile varia dal 50-85% nei paesi più sviluppati, mentre è >90% nei paesi ad alta densità di popolazione e basso livello socioeconomico. Un’altra condizione a rischio aumentato di contagio è rappresentata dalla presenza in casa di bambini o dal lavoro in comunità infantili. Materiali che possono contagiare sono urine, secrezioni orofaringee, vaginali e cervicali, latte materno, lacrime e sangue. Si ha un’infezione primaria al primo contatto con il virus, mentre l’infezione ricorrente si verifica in soggetti già infettati o per riattivazione di ceppi endogeni latenti o per reinfezione con un nuovo ceppo.

Cod. EBVI: EBV-DNA (Epstein Barr Virus) Qualitativo

Il virus di Epstein Barr (EBV)è ubiquitario ed oltre ad essere stato identificato come l’agente infettante in molti casi di mononucleosi, gioca un ruolo significativo come cofattore nei processi di oncogenesi. Il virus si trasmette per via orale; replica inizialmente nell’epitelio orofaringeo ed in quello delle ghiandole salivari. L’intima associazione nell’orofaringe tra cellule epiteliali e linfoidi favorisce la rapida infezione dei linfociti B presenti in questo distretto ed assicura l’entrata delle cellule B infettate da EBV nel circolo sanguigno. DNA o proteine di EBV sono state riscontrate nel linfoma di Burkitt, in pazienti con AIDS e in disordini linfoproliferativi legati ai trapianti, nella malattia di Hodgkin, in certi linfomi ad alto grado a cellule T e B e nel carcinoma nasofaringeo. I tradizionali strumenti diagnostici non sono facilmente utilizzabili per la valutazione delle patologie legate al virus di Epstein Barr in pazienti immunodepressi; nemmeno l’esame colturale si dimostra essere pratico e utile in clinica; la sierologia è difficile da interpretare e limitata nella valutazione dei tumori legati ad EBV.

Cod. HBVI: HBV-DNA Qualitativo / Cod. HBVQ: HBV-DNA Quantitativo

La diagnosi di infezione da HBV avviene di solito mediante la ricerca nel siero dell’antigene di superficie Hbs Ag. Nelle epatiti acute o croniche da HBV l’ Hbs Ag rimane nel siero molto più a lungo rispetto al virus intatto. La ricerca diretta del genoma virale dell’ HBV è quindi fondamentale, sia per monitorare i vari stadi durante la terapia antivirale, sia per diagnosticare l’infezione quando non è ancora evidenziabile la risposta anticorpale (periodo finestra). I portatori sani che sono positivi alla ricerca dell’ HbsAg ma non sviluppano la malattia epatica, sono negativi alla ricerca del genoma dell’ HBV.I fattori che aumentano il rischio di trasmissione verticale sono la comparsa di epatite acuta nel corso del terzotrimestre di gravidanza, il parto durante il periodo di incubazione materna del virus e la presenza dell’antigene HBe nelle madri portatrici croniche. Madre portatrice asintomatica di HBsAg Il rischio di trasmissione perinatale aumenta dal 10-20% al 70-90% in caso di positività materna per l’antigene e, in quest’ultimo caso, il bambino svilupperà un’epatite cronica o lo stato di portatore cronico entro il primo anno di vita in una elevata percentuale di casi (70-90%). La trasmissione del virus è più frequente al momento del parto o nell’immediato postpartum. Il rischio di trasmissione è molto basso in caso di infezione materna al I o II trimestre di gravidanza, ma aumenta al 50-70% se l’epatite insorge nel III trimestre di gravidanza o subito dopo il parto;il rischio di trasmissione attraverso l’allattamento al seno è molto controverso: l’HBsAg è presente nel latte in circa il 70% dei casi, ma la trasmissione per via orale richiede una carica virale molto virale più elevata, per cui l’allattamento al seno è consentito se la madre è HBeAg negativa. L’infezione neonatale può essere anche legata a trasmissione orizzontale in caso di familiari portatori di HBsAg. I neonati che contraggono l’infezione più spesso divengono portatori cronici asintomatici; in alcuni casi tuttavia anche in assenza di sintomatologia clinica si possono avere forme silenti di epatite cronica con elevazione dei valori degli enzimi epatici e segni di epatite cronica alla biopsia epatica. Rari sono i casi di epatite fulminante neonatale; poco più frequenti sono le forme di epatite acuta. Il trattamento dei neonati di madre HBsAg positiva consiste nella immunizzazione passiva con immunoglobuline ed in quella attiva con vaccino specifico.Il trattamento prevede la somministrazione di immunoglobuline specifiche (HBIG) alla dose di 0,5 ml e della prima dose di vaccino entro 12 ore dalla nascita. L’immunizzazione attiva e passiva hanno buona efficacia nel prevenire la trasmissione perinatale della malattia (90-95%), mentre la sola immunizzazione attiva previene l’infezione nel 70-90% dei casi. La prevenzione dell’infezione da HVB in Italia rientra nei programmi di vaccinazione obbligatoria.

Cod. HCVI: HCV-RNA Qualitativo

Il virus HCV (virus ad RNA) causa la maggior parte delle epatiti non A e non B. Tramite la trascrizione inversa e la successiva amplificazione, si può rilevare la presenza del virus nel siero o nelle biopsie epatiche. Ciò permette pertanto sia di rilevare la presenza del virus quando ancora non è evidenziabile la risposta anticorpale (periodo finestra), sia di verificare l’ effetto terapeutico della terapia interferonica od antivirale in genere (analisi quantitativa). Inoltre, in caso di soggetti con ALT normali ed infezione cronica la ricerca del genoma virale è necessaria per sapere se il virus è inattivo (esame negativo) o se il virus pur replicandosi (esito positivo) non è stato in grado fino a quel momento di danneggiare il fegato in modo significativo.Il virus dell’HCV è altamente variabile. Fino ad oggi sono stati individuati nove tipi che si suddividono poi in molteplici sottotipi. In Italia sono diffusi soprattutto i sottotipi 1a, 1b, 2a, 2c, 3. Poiché esiste una stretta correlazione tra il genotipo del virus HCV e la risposta alla terapia interferonica, la conoscenza del sottotipo infettante risulta essere un dato fondamentale per una corretta impostazione della terapia. L’epatite C è un’infezione a distribuzione ubiquitaria con una prevalenza nella popolazione generale che va dallo 0,3% all’1,4%. La frequenza di infezione in una popolazione normale di donne gravide non selezionate è calcolata intorno allo 0,55-2,9%. Tali percentuali aumentano nei gruppi ad alto rischio di contrarre l’infezione. E’ stata descritta la trasmissione perinatale del virus HCV la cui frequenza è estremamente variabile nei diversi studi: dallo 0,6% all’87% in lavori su piccoli gruppi di neonati ad alto rischio. E’ stato supposto che l’infezione possa essere trasmessa dalla madre al bambino attraverso diverse vie: in utero, al momento del parto attraverso l’allattamento. Sembra comunque che l’infezione si verifichi durante il parto. L’infezione da HCV è caratterizzata da un quadro clinico di lieve entità con un esordio insidioso con ittero e malessere; spesso la sintomatologia può essere anche completamente assente. Il 50% dei pazienti infettati sviluppa un’epatite cronica che può evolvere verso la cirrosi. Nei nati da madri che presentano anticorpi anti-HVC sono state osservate diverse modalità di presentazione dell’infezione: bambini con viremia transitoria, normali livelli sierici di transaminasi, assenza di Ab anti HCV; un quadro acuto con elevazione dei livelli sierici di transaminasi, presenza di Ab anti HCV e presenza di HCV-RNA nel sangue fino a 18 mesi; un quadro di epatite cronica asintomatica con valori sierici di transaminasi fluttuanti. Dal 1990, sono disponibili test sierologici, per la ricerca di Ab anti-HCV in soggetti con sospetta infezione perinatale. La diagnosi viene confermata mediante la ricerca di HCV-RNA con la PCR, tale metodica sembra essere attualmente la più sensibile. Prevenzione e trattamento La prevenzione dell’infezione perinatale dell’epatite C si basa sulla ricerca per gli Ab anti-HCV nel siero di donne gravide. Inoltre, non esiste al momento attuale alcun vaccino per la prevenzione della malattia. Per il trattamento dell’infezione cronica da HCV è stato approvato l’uso dell’interferone-alfa. Non è noto se la modalità di parto influisca sulla trasmissione perinatale del virus HCV. Tuttavia in uno studio è stata riportata una frequenza significativamente maggiore di infezione nei nati da parto per via vaginale (32%) rispetto ai nati da parto con taglio cesareo (6%). Molte delle madri HCV positive erano coinfettate con l’HIV. I dati sulla trasmissione del virus HCV durante l’allattamento sono contrastanti. È stata suggerita una correlazione tra elevata attività di malattia (titolo anticorpale elevato, valori di transaminasi e di HCV RNA elevati) e riscontro di HCV RNA nel latte materno con conseguente aumentata possibilità di trasmissione della malattia attraverso questa via. D’altra parte, in diversi studi non è stata dimostrata la trasmissione del virus attraverso l’allattamento, quindi non vi sono controindicazioni precise, ufficialmente riconosciute, per l’allattamento materno in donne HCV infette.

Cod. HIVQ: HIV-RNA Quantitativo

L’HIV è ampiamente riconosciuto come l’agente causale dell’AIDS in cui la conseguenza principale dell’infezione è la deplezione della popolazione cellulare bersaglio che porta all’immunosoppressione ed alle infezioni opportunistiche. Il virus dell’HIV è un virus ad RNA ed appartiene alla sottofamiglia delle Lentivirinae. Come tutti i Retrovirus il genoma dell’HIV è costituito da tre geni fondamentali (gag, pol, env) racchiusi tra due sequenze non codificanti proteine, definite long terminal repeats (LTR). Su questa struttura base l’HIV possiede un corredo di geni addizionali a funzione regolatoria ed accessoria (tat, Nef, Vif, Vpr, Rey, U). Il recettore cellulare dell’HIV è la molecola CD4, già nota agli immunologi prima dell’AIDS in quanto marker di membrana di un sottotipo di linfociti T a funzione helper/inducer. Una volta dentro la cellula l’RNA virale è convertito in molecole di DNA, tramite l’attivazione della trascrittasi inversa, che in parte si integrano nel genoma ospite ed in parte persistono in forma libera (provirus). Due specie di HIV sono in grado di infettare l’uomo: l’HIV-1 e HIV-2. HIV-1. Il virus HIV-1 è più virulento e facilmente trasmissibile ed è la causa della maggior parte delle infezioni da HIV a livello globale. Invece l’ HIV 2 è meno facilmente trasmissibile ed è più facilmente riscontrabile nelle regioni Africane.

Cod. HIVR: HIV-RNA Resistenza ai farmaci

I pazienti affetti da virus HIV-1 vengono sottoposti ad una terapia che prende il nome di HAART (highly active antiretroviral therapy) che consiste nella combinazione di tre o più farmaci. La conquista maggiore della cura HAART è quella di bloccare completamente la replicazione del virus HIV-1. Nonostante i circa 18 farmaci anti-retrovirali, appartenenti a 4 distinte classi di farmaci, si sta osservando un drammatico aumento delle terapie che non hanno effetti sull’infezione. Uno dei fattori della crescita di terapie prive di effetto consiste nell’abilità del virus HIV-1 di modificare o mutare in risposta a pressioni farmacologiche e di sviluppare resistenza ad uno o più farmaci antiretrovirali. La selezione e la combinazione di farmaci per eliminare o evitare la resistenza è la strategia attualmente accettata per i trattamenti a lungo termine dei soggetti affetti. Il virus HIV è in grado di convertire RNA a DNA attraverso l’azione dell’enzima virale Reverse Transciptase (RT). Il DNA virale viene integrato ne genoma dell’ospite come provirus. L’enzima RT ha una bassa capacità di correzione delle bozze con conseguente incorporazione, del DNA provirale, di errori durante la replicazione. Questi errori posso determinare una selezione vantaggiosa per il virus in presenza di anti-retrovirali. I limiti di questa resistenza possono essere determinati direttamente dalla sequenza dei geni che codificano per le protasi e per gli enzimi RT, che sono i target specifici dei farmaci antiretrovirali.