Trombofilia Genetica

Diagnosi Molecolare di Trombofilia Ereditaria mediante Analisi di Mutazione dei Geni del Fattore V, Fattore II e MTHFR, APO E, APOB, Fattore XIII, PAI-1, HPA, Beta Fibrinogeno

Le trombofilie ereditarie (predisposizione genetica alla trombosi) sono un gruppo di patologie caratterizzate dalla tendenza a soffrire di episodi trombotici. Si ha un evento trombotico, venoso o arterioso, quando il sangue (anche in piccole quantità) si coagula all’interno di un vaso sanguigno, aderisce alla sua parete e lo ostruisce in maniera parziale o completa, impedendo il flusso del sangue. Il coagulo prende il nome di trombo.  Nella maggior parte dei casi si tratta di difetti o alterazioni di uno o più fattori della coagulazione del sangue. La coagulazione e’ un processo molto complesso che prevede l’intervento in successione di molti fattori (proteine) diversi. Si tratta di un evento a cascata, una specie di reazione a catena.  I geni, oggi noti, di suscettibilità alla trombosi sono delle varianti geniche (mutazioni puntiformi ad un singolo nucleotide) che presentano una tale frequenza nella popolazione da essere considerate delle varianti polimorfiche. I geni in considerazione sono quelli relativi al Fattore V di Leiden, al Fattore II della coagulazione (protrombina) ed il gene MTHFR (Metilentetraidrofolatoreduttasi. Altri geni sono stati associati a stati trombotici, tra i quali: Fattore XIII, Beta Fibrinogeno, PAI-1, HPA, HFE, APO E, APOB,ACE, AGT.

Lo studio delle varianti geniche di questi geni è indicata in:

  • Soggetti con precedenti episodi di tromboembolismo venoso o trombosi arteriosa;
  • Donne che intendono assumere contraccettivi orali;
  • Donne con precedenti episodi di trombosi in gravidanza;
  • Donne con poliabortività
  • Donne con precedente figlio con DTN ( difetto tubo neurale);
  • Gestanti con IUGR, tromboflebite o trombosi placentare;
  • Soggetti diabetici.

vedi anche Trombofilia e Abortività

Descrizione dei geni analizzati:

Cod. F2: Ricerca della mutazione G20210A nel gene del FATTORE II (Protrombina)

La protrombina o fattore II della coagulazione svolge un ruolo fondamentale nella cascata coagulativa in quanto la sua attivazione in trombina porta alla trasformazione del fibrinogeno in fibrina e quindi alla formazione del coagulo.  E’ stata descritta una variante genetica comune nella regione non trascritta al 3′ del gene che è associata ad elevati livelli di protrombina funzionale nel plasma e conseguente aumentato rischio di trombosi, specie di tipo venosa. Trattasi di una sostituzione di una G (guanina) con una A (adenina) alla posizione 20210 (G20210A), una regione non trascritta del gene dalla parte del 3′ che è sicuramente coinvolta nella regolazione genica post-trascrizionale, quale la stabilità dell’RNA messaggero o con una maggiore efficienza di trascrizione del messaggero stesso. La frequenza genica della variante è bassa (1,0-1,5%) con una percentuale di eterozigoti del 2-3%. L’omozigosi è rara. Per gli eterozigoti c’è un rischio aumentato di 3 volte di sviluppare una trombosi venosa, di 5 volte per l’ictus ischemico, di 5 volte per infarto miocardico in donne giovani, di 1,5 volte per gli uomini, di 7 volte nei diabetici, di 10 volte per trombosi delle vene cerebrali e di 149 volte in donne che assumono contraccettivi orali.

Cod. F5: Ricerca della mutazione G1691A nel gene del FATTORE V (Leiden)

Il Fattore V attivato è un cofattore essenziale per l’attivazione della protrombina (fattore II) a trombina. Il suo effetto pro-coagulante è normalmente inibito dalla Proteina C attivata che taglia il fattore V attivato in tre parti. Un sito di taglio è localizzato nell’aminoacido arginina alla posizione 506.
Una
mutazione del gene che codifica per il fattore V, a livello della tripletta nucleotidica che codifica per l’arginina in 506 ( nucleotide 1691), con sostituzione di una G (guanina) con una A ( adenina), comporta la sostituzione dell’arginina con un altro aminoacido, la glutammina che impedisce il taglio da parte della Proteina C attivata. Ne consegue una resistenza alla proteina C attivata (APC) nei test di laboratorio ed una maggiore attività pro-coagulante del fattore V attivato che predispone alla trombosi. Tale variante G1691A è definita variante di Leiden (località in cui fu scoperta), ed ha una frequenza genica dell’ 1,4-4,2% in Europa con una frequenza di portatori in eterozigosi in Italia pari al 2-3%, mentre l’omozigosità per tale mutazione ha un’incidenza di 1:5000. I soggetti eterozigoti hanno un rischio 8 volte superiore di sviluppare una trombosi venosa, mentre gli omozigoti hanno un rischio pari ad 80 volte. Tale evento trombotico è favorito in presenza di altre condizioni predisponenti quali la gravidanza, l’assunzione di contraccettivi orali (rischio aumentato di 30 volte negli eterozigoti e di alcune centinaia negli omozigoti), gli interventi chirurgici. In gravidanza una condizione genetica di eterozigosi per il Fattore Leiden è considerata predisponente all’aborto spontaneo, alla eclampsia, ai difetti placentari , alla Sindrome HELLP (emolisi, elevazione enzimi epatici, piastrinopenia). Tali manifestazioni sarebbero legate a trombosi delle arterie spirali uterine con conseguente inadeguata perfusione placentare. I soggetti portatori di mutazione del Fattore V di Leiden dovrebbero pertanto sottoporsi a profilassi anticoagulativa in corso di gravidanza o in funzione di interventi chirurgici ed evitare l’assunzione di contraccettivi orali.

Cod. F5H: Ricerca della mutazione H1299R nel gene del FATTORE V

E’ chiamata più comunemente allele R2.
Da sola dà una debole resistenza alla proteina c attivata, ma in combinazione con l’altra combinazione del Fattore V Leiden aumenta ulteriormente il fattore di rischio di trombosi. Rappresenta inoltre un fattore di rischio di infarto celebrale di circa il 3,9%

Cod. MTHFR1/MTHFR2: Ricerca delle mutazioni C677T e A1298C nel gene MTHFR

La metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR) è un enzima coinvolto nella trasformazione del 5-10 metilentetraidrofolato in 5 metiltetraidrofolato che serve come donatore di metili per la rimetilazione della omocisteina a metionina tramite l’intervento della vitamina B12. Rare mutazioni ( trasmesse con modalità autosomica recessiva) possono causare la deficienza grave di MTHFR con attività enzimatica inferiore al 20% e comparsa di omocisteinemia ed omocistinuria e bassi livelli plasmatici di acido folico. La sintomatologia clinica è grave con ritardo dello sviluppo psico-motorio e massivi fenomeni trombotici. Accanto alla deficienza grave di MTHFR è stato identificato un polimorfismo genetico comune, dovuto alla sostituzione di una C (citosina) in T (timina) al nucleotide 677 (C677T), che causa una sostituzione di una alanina in valina nella proteina finale ed una riduzione dell’attività enzimatica della MTHFR pari al 50% ,fino al 30% in condizioni di esposizione al calore (variante termolabile).Tale variante comporta livelli elevati nel sangue di omocisteina specie dopo carico orale di metionina. La frequenza genica in Europa della mutazione è del 3-3,7% che comporta una condizione di eterozigosi in circa il 42-46% della popolazione e di omozigosi pari al 12-13%. Recentemente, una seconda mutazione del gene MTHFR (A1298C) è stata associata ad una ridotta attività enzimatica (circa il 60% singolarmente; circa il 40% se presente in associazione alla mutazione C677T). Questa mutazione, in pazienti portatori della mutazione C677T, determina un’aumento dei livelli ematici di omocisteina. Livelli aumentati di omocisteina nel sangue sono oggi considerati fattore di rischio per malattia vascolare, (trombosi arteriosa) forse attraverso un meccanismo mediato dai gruppi sulfidrilici sulla parete endoteliale dei vasi. Inoltre in condizioni di carenza alimentare di acido folico la variante termolabile della MTHFR porta a livelli molto bassi l’acido folico nel plasma ed è pertanto un fattore di rischio per i difetti del tubo neurale nelle donne in gravidanza. Condizioni di eterozigosi doppia, specie con la variante Leiden del fattore V comporta o della variante 20210 della protrombina, può aumentare il rischio relativo per il tromboembolismo venoso, già alto per la presenza dell’altra variante.

Cod. PAI: Ricerca della mutazione 4G/5H gene del PAI-1

Il sistema fibrinolitico, meccanismo opposto a quello della coagulazione ed in equilibrio con esso in condizioni di normale flusso sanguigno, è basato sul plasminogeno, che è convertito in plasmina dall’ attivatore del plasminogeno, sia del tipo tissutale (t-PA) che del tipo urochinasi (u-PAI). L’ inibitore-1 dell’ attivatore del plasminogeno (PAI-1) è il maggiore inibitore del sistema fibrinolitico ed è prodotto da una varietà di cellule tra cui il fegato, le piastrine, le cellule endoteliali e quelle muscolari liscie delle pareti vasali. PAI-1 è un membro della famiglia SERPIN e si lega all’ attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) inibendone l’ attivazione, con conseguente diminuita fibrinolisi. Elevati livelli di questo inibitore sono stati associati ad un maggior rischio trombotico, sia di tipo arterioso (infarto miocardico e malattia coronarica) che venoso (tromboembolismo), specie nei soggetti fumatori ed ipertesi. Il suo livello plasmatico è infatti aumentato dopo intervento chirurgico e comporta una riduzione dell’ attività fibrinolitica che potrebbe giustificare l’ ipercoagulabilità post-operatoria osservata. Inoltre il bilanciamento tra gli attivatori del plasminogeno ed il loro inibitore svolgerebbe un ruolo di primo piano nella formazione del trombo arterioso dopo la rottura di una placca ateromatosa. Elevati livelli di PAI-1 sono anche osservati in corso di sindrome plurimetabolica, in associazione con l’ ipertensione, l’ obesità, l’ insulino-resistenza, gli elevati livelli di trigliceridi e le basse concentrazioni di lipoproteine ad alta densità (HDL). Il gene PAI-1 presenta un polimorfismo (SNP) di inserzione/delezione di una singola G (4G/5G) alla posizione -675 dal sito di inizio del gene, all’ interno di una regione regolatoria al 5` (promotore). Il 26% della popolazione presenta un genotipo 4G/4G, il 50% è eterozigote (4G/5G) ed il 24% possiede un genotipo 5G/5G. L’ allele 4G è stato associato ad un aumentatato rischio trombotico, in quanto correlato ad un aumento dell’ attività trascrizionale del gene e quindi ad aumentati livelli plasmatici di PAI-1, che nella condizione di omozigosi 4G/4G sono il 25% più alti rispetto ai soggetti con genotipo 5G/5G. Si ritiene infatti che il promotore con la mutazione 4G sia in grado di legare solo un enhancer, mentre l’ allele 5G sia in grado di legare sia un enhancer che che un suppressor. Successivamente è stato dimostrato che il promotore di PAI-1 esibisce una risposta ai trigliceridi genotipo-specifica, con più alti livelli di PAI-1 nei soggetti con il genotipo 4G/4G in presenza di elevati livelli di trigliceridi. Infine, donne in corso di gravidanza con genotipo 4G/4G risultano avere una maggiore incidenza di complicanze della gravidanza ed al parto rispetto ai soggetti 5G/5G.

Cod. FXIII: Ricerca della mutazione Val34Leu nel gene del FATTORE XIII

Uno stato di omozigosi per un particolare polimorfismo del gene del Fattore XIII (F13A1), consistente in transizione G->T a livello dell’esone 2 del gene, con conseguente variazione aminoacidica  leucina -> valina a livello del  codone 34, che è molto prossimo al sito di attivazione della trombina, è stata associata a un aumento elevato dell’attività di questo enzima.  La presenza di tale mutazione in omozigosi, quindi, rappresenterebbe un fattore protettivo contro trombosi venose.

Cod. GP3: Ricerca della variante Gpllb/llla (ITGB3)

La genotipizzazione dello Human Platelet Alloantigens (HPA) permette di distinguere le due forme alleliche Pl (A1) e Pl (A2) determinate dal polimorfismo Leu33Pro, consistente in una variazione nucleotidica da T(A1) a C (A2) in posizione 1565, esone 2 del gene ITGB3, con conseguente variazione aminoacidica Leu->Pro a livello del codone 33. Differenti studi hanno associato la presenza di almeno un allele Pl (A2) a stati di ipercoagulazione, con conseguenti complicanze trombotiche venose.

Cod. FIBRB: Ricerca della mutazione G455A nel gene del Beta-fibrinogeno

Il polimorfismo presente all’interno del promotore del gene codificante il fibrinogeno, consiste nella sostituzione di una guanina con un adenina nella posizione nucleotidica 455 e comporta un aumento dell’attività trascrizionale del gene con conseguente aumento della concentrazione ematica di beta fibrinogeno, responsabile della coagulabilità del sangue. La presenza della mutazione è associata ad un maggior rischio di manifestare trombosi venose profonde. E’ quindi consigliabile ai portatori del polimorfismo di dosare il fibrinogeno plasmatico e di modificare lo stile di vita eliminandoi fattori che favoriscono un aumento di fibrinogeno come il fumo e l’inattività fisica.

Cod. E112/E158: Ricerca delle mutazioni C112R e R158C nel gene della Apolipoproteina E

(APO E L’Apolipoproteina E (APOE) è una proteina plasmatica, coinvolta nel trasporto del colesterolo, che si lega alla proteina amiloide, e della quale esistono tra diverse forme: APOE2, APOE3 ed APOE4, codificate da tre diversi alleli (E2, E3, ed E4). Le apolipoproteine  svolgono un ruolo fondamentale nel catabolismo delle lipoproteine ricche di trigliceridi e colesterolo. Recenti studi clinici fanno dimostrato che l’allele 4 (APOE4) è più frequente nelle persone affette da malattia di Alzheimer rispetto a quelle sane. La presenza del genotipo APOE4, anche in eterozigosi, determinerebbe un aumento di circa 3 volte del rischio di sviluppare la malattia nelle forme ad esordio tardivo, familiari e sporadiche.

Cod. APB: Ricerca della mutazione R3500Q nel gene dell' APO B

L’Apolipoproteina B (Apo B) è un costituente fondamentale delle proteine a bassa e molto bassa densità coinvolte nel metabolismo del colesterolo. La mutazione R3500Q nel gene che codifica per la Apo B porta a ipercolesterolemia e conseguente rischio di patologie cardiovascolari